创新先锋 |蔡司 Apotome 3——高品质结构光学照明从未如此简便易用
"刚拍的神经元细胞成像图，一言难尽......"
"哦？用了什么显微镜？"
"普通宽场呗，糊糊的，又要被老板嫌弃了......"
听完老朋友小赛的吐槽，蔡司君默默拿出一个组件：
这是蔡司新出的产品——蔡司光学切片组件Apotome 3（点击查看），利用结构照明，可以简单有效地在宽场显微镜系统下消除非焦平面杂散光，在更为经济的硬件扩展模式下，实现接近共聚焦显微镜的高品质光学切片成像效果。
光学切片组件Apotome 3的应用
皮质神经元：DNA和微管染色的三维渲染
▲ 左图为宽场显微镜所拍摄，右图为蔡司Apotome所拍摄。分辨率的提高显著优化了图像质量。图片由德国莱布尼茨老龄化问题研究所Fritz-Lipmann-Institut e.V.（FLI）的L. Behrendt 提供
蔡司Apotome 3能够自动识别物镜放大倍率并将适当的栅格移至光路中，并根据不同栅格的位置获得多幅图像，其中包括光学切片图像。此方法非常有效地消除了非焦平面杂散光，与传统宽场荧光显微镜生成的图像相比，蔡司Apotome 3能够显著提高轴向分辨率：即使是在如果蝇、小鼠胚胎等具有一定厚度的样品中，也能得到支持三维渲染的优质光学切片。
果蝇胚胎的光学切片
▲ 绿色：HRP，红色：glia，Z 轴序列图像。100μm图片由德国明斯特大学神经生物学研究所的C. Klämbt 提供
小鼠胚胎的光学切片
▲ 绿色：GFP，红色：Cy3，物镜：Plan Apochromat 40×/1.3油镜。图片由德国哥廷根大学解剖学中心的N. Büttner 和T. Vogel 提供
凭借蔡司Apotome 3光学切片技术特有的去卷积算法，图像质量可得到进一步改善。在保留所有原始数据的同时，该系统还允许在宽场、光学切片以及反卷积的图像之间切换，实现出色的灵活性和兼容性。反卷积算法快速、稳健且易于使用，能够提高图像的分辨率。通过改善对比度、提高光学分辨率和抑制背景噪音，蔡司Apotome 3可以更好地解析样品深层次中更细微的结构。
受精4天后的转基因斑马鱼幼体的光学切片
▲ 受精4天后的转基因斑马鱼幼体，胶质纤维酸性蛋白、乙酰化微管蛋白、绿色荧光蛋白和DNA的荧光信号。包埋于1.2%低熔点琼脂糖中。图片由莱布尼茨老龄化问题研究所的Fritz-Lipmann-Institut e.V.（FLI）的 H. Reuter 提供
蔡司Apotome 3不仅为动物研究做出贡献，在植物研究领域同样有不俗的表现：
感染共生菌的百脉根的光学切片
▲ 感染了共生菌的百脉根，观察自发荧光和mCherry标记的共生菌。图片由德国弗莱堡大学的 F.A.Ditengou 提供
光学切片组件Apotome 3的原理
出色的成像效果，离不开背后高科技的加持。传统宽场显微镜在成像时，相机会检测到焦平面以外区域的发射光，因而使得对比度和分辨率降低（下图图A）。
▲ A：传统荧光显微镜所拍摄；B-E：蔡司Apotome 3所拍摄
蔡司Apotome 3则将栅格结构投影到样品的焦平面中，栅格与焦平面信号形成强烈的干涉条纹，而非焦平面处则条纹不明显，其杂散光信号被抑制，然后使用扫描方式将栅格移动到不同位置，进而扫描整个视野。（图B，C和D）。
因此蔡司Apotome 3在每一栅格位置都能够自动获取一张数字图像，系统使用特有算法将所有的图像处理成一个具有高对比度和分辨率的光学切片图像（图E）。
光学切片成像技术的发展历程
蔡司Apotome 3有别于一般仅依靠算法提高宽场分辨率的方法，是真正能被看见的技术，其发展已有20多年历史。
1998年，在牛津大学的科学家托尼·威尔逊(Tony Wilson)首次提出使用结构化照明代替均匀的宽视场照明，在传统荧光显微镜中使用光学切片。这一绝妙的构思很快由蔡司商业化：2002年，蔡司发布了第一代光学切片成像技术ApoTome,收获了不俗的市场反响。
随着蔡司光学切片成像技术的日渐成熟，蔡司于2010年发布了全新电动ApoTome.2。这一技术可自动匹配物镜并加入了自带反卷积算法，从而进一步提升图像信噪比。此后十年，拥有着广泛客户基础的ApoTome.2开启了“霸屏”模式。
经过时光的历练和技术的沉淀后，2020年10月，蔡司带着新一代Apotome 3走来，重新进行了硬件设计，使得整体更加简洁，同时性能更加稳定可靠，并支持多种最新的荧光光源，满足不同用户的使用需求。此外，Apotome 3也支持蔡司ZEN软件中广受好评的“Direct Processing”功能，客户在采集图像时，可以同步进行图像运算处理，真正做到“一键即得”的简单操作体验。
听蔡司君讲了这么多，小赛的惊叹声不绝于耳，接连问了几个大家都非常关心的问题，
Q1
这么神奇，使用复杂吗？只能搭配高倍镜使用吧？
不会啊，操作非常简单，和你平时拍照一样。此外，物镜倍数随便选~在对从几百微米到纳米的结构成像时，通常使用带有不同放大倍数的物镜。Apotome 3配有三种不同几何结构的栅格，可让各种物镜达到理想的分辨率。
Q2
染料有什么限制？
没有啊，无论是DAPI、Alexa488、Rhodamin、Cy5等荧光染料，还是GFP、mCherry等活体染料，都可自由选择，不受技术制约。另外，在光源的选择上，Apotome 3可以与传统的金属卤化物灯、经济型白光LED灯或光线柔和多色的Colibri照明系统配合使用。只需更换滤色片，系统便会自动将栅格移至正确位置。
没等蔡司君说完，双眼“放光”的小赛已经跑回实验室向老板和科研小伙伴们去“安利”这款神器。蔡司君接下来给大家总结一下常见应用和解决方案：
蔡司Apotome 3是提供经济、高效、高对比度、高分辨率的光学切片成像解决方案。基于出色的光学切片成像技术、自由选择光源和荧光染料，您可获取更多微观结构信息。从组织切片和细胞培养,到全胚胎的广泛应用中，蔡司Apotome 3为您量身定制，优势尽显，上面的典型应用总有一款合适您，快来试试吧。
（位鹏 李泽惠 蔡司显微镜 ）
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